亦稱傳代培養保藏法，包括斜面培養、穿刺培養、液體培養等。是指將菌種接種於適宜的培養基中，最適條件下培養，待生長充分後，於4～6℃進行保存並間隔一定時間進行移植培養的菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.培養基製備
1.1器皿準備
培養基製備過程中所用的一些玻璃器皿，如，三角瓶、試管、培養皿、燒杯、吸管等，經洗滌、乾燥、包裝、滅菌後使用。
1.2溶解培養基配料
先在燒杯中放適量水，按培養基配方稱取各項材料，依次將緩衝化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最後加足水量，攪拌均勻。
1.3調pH值
配料溶解後將培養基冷卻至室溫，根據要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀鹼(10%氫氧化鈉)調pH值。加酸或鹼液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過鹼或過酸而導致測量不準確和營養成分被破壞。
1.4加凝固劑
配製固體培養基時需加凝固劑，如，瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養基中，加熱並不斷攪拌至融解，再補足所蒸發水分。
1.5過濾分裝
在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養基趁熱過濾並分裝。斜面培養基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養基沾汙管口，以免弄溼棉塞造成汙染。
1.6包紮標記
將試管加棉塞，外面包紮一層牛皮紙或鋁箔並註明培養基名稱及配製日期。
1.7滅菌
根據要求將培養基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。
1.8斜面擺放
滅菌後及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。
1.9無菌檢查
將滅菌的培養基放入培養箱中作無菌檢驗，通常30℃培養1～3天。無菌檢查合格後將其保存於4℃下備用。
2.接種
2.1斜面接種
2.1.1點接
把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用於擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類黴菌（如，毛黴、根黴等）。
2.1.2中央劃線
從斜面中央自下而上劃一直線。適用於細菌和酵母菌等。
2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法
從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用於易擴散的細菌，也適用於部分真菌。
2.1.4密波狀蜿蜒劃線法
從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用於細菌和酵母菌等。
2.1.5挖塊接種法
挖取菌絲體連同少量培養基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。
2.2穿刺接種
用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然後沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用於細菌和酵母菌等。
2.3液體接種
挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種於新鮮液體培養基中。
3.培養
將接種後的培養基放入培養箱中，在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30～37℃，真菌培養溫度一般為25～28℃。
4.保藏
培養好的菌種於4～6℃保存，根據要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊黴等，須1～3個月移植一次。
保藏溼度用相對溼度表示，通常為50%～70%。
斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和汙染造成損失。
液體石蠟保藏法
亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養基上，最適條件下培養至菌種長出健壯菌落後注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置於低溫（4～6℃）乾燥處進行保存的一種菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.液體石蠟的準備
選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，採用以下兩種方式進行滅菌：
121℃溼熱滅菌30min，置40℃恆溫箱中蒸發水分，經無菌檢查後備用。
160℃乾熱滅菌2個小時，冷卻後，經無菌檢查後備用。
2.斜面培養物的製備
參照定期移植法。
3.灌注石蠟
將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養好的新鮮斜面培養物上，液麵高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。
4.保藏
4.1注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態置低溫（4～6℃）乾燥處保藏，保藏時間2～10年。
4.2保藏期間應定期檢查，如，培養基露出液麵，應及時補充無菌的液體石蠟。
5.恢復培養
恢復培養時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養基上，生長繁殖後，再重新轉接一次。
沙土管保藏法
是載體保藏法的一種。將培養好的微生物細胞或孢子用無菌水製成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種於滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽乾後熔封管口或置乾燥器中於4～6℃或室溫進行保存的一種菌種保藏方法。
操作步驟如下：
1.沙土管制備
將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時後倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘乾或晒乾。
另取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩，水洗至中性，烘乾。
將處理後的沙、土按質量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃溼熱滅菌30min。
隨機抽取滅菌後的砂土管若干支，無菌條件下取少許砂土至營養肉汁培養基中，30℃培養24小時，檢查無微生物生長後方可使用。
2.斜面培養物的製備
參照定期移植法。
3.製備菌懸液
向培養好的斜面培養物中注入3～5mL無菌水，洗下細胞或孢子製成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和黴菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。
4.乾燥
真空抽去沙土管中水分。
5.保藏
將沙土管用火焰熔封后存放於低溫(4～6℃)乾燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置乾燥器內保存，保藏時間2～10年。
6.恢復培養
無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒於適宜的斜面培養基上，長出菌落後再轉接一次。或取沙土粒於適宜的液體培養基中，增殖培養後再轉接斜面。
冷凍乾燥
將微生物冷凍，在減壓下利用昇華作用除去水分，使細胞的生理活動趨於停止，從而長期維持存活狀態。
【好氧菌冷凍乾燥管的製備】
操作步驟如下：
1.安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗乾淨後，用蒸餾水浸泡至pH中性，乾燥後、貼上標籤，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞後，121℃下高壓滅菌15～20分鐘，備用。
2.保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配製保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2～3次，每次10～30分鐘，備用。
3.凍幹樣品的準備
在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查後（參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少於108～1010個/mL為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。採用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺汙上部管壁，每管分裝量約0.1～0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然後將培養物與保護劑混勻，再分裝於安瓿管中。分裝安瓿管時間儘量要短，最好在1～2小時內分裝完畢並預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4.預凍
一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5.冷凍乾燥
採用冷凍乾燥機進行冷凍乾燥。
將冷凍後的樣品安瓿管置於冷凍乾燥機的乾燥箱內，開始冷凍乾燥，時間一般為8～20小時。
6.真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然後採用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。
熔封后的乾燥管可採用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7.保藏
安瓿管應低溫避光保藏。
8.質量檢查
冷凍乾燥後抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如，存活率、生產能力、形態變異、雜菌汙染等。
【厭氧菌冷凍乾燥管的製備】
主要程序與需氧菌操作相同，注意保護劑的選擇和準備，保護劑使用前應在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣後放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。
復甦方法
——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部；
——將安瓿管頂部燒熱；
——用無菌棉籤沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端；
——用無菌水或培養液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養基上，進行適溫培養。
【-80℃低溫冷凍保藏】
是將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。
操作步驟如下：
1.安瓿管的準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗乾淨後，用蒸餾水浸泡至pH中性，乾燥後、貼上標籤，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞後，121℃下高壓滅菌15～20分鐘，備用。
2.保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配製保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2～3次，每次10～30分鐘，備用。
3.微生物保藏物的準備
在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查後（參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少於108～1010個/mL為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。採用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺汙上部管壁，每管分裝量約0.1～0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然後將培養物與保護劑混勻，再分裝於安瓿管中。分裝安瓿管時間儘量要短，最好在1～2小時內分裝完畢並預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。
4.凍結保藏
將安瓿管或塑料凍存管置於-80℃冰箱中保藏。
5.復甦方法
從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38℃～40℃水浴中快速復甦並適當快速搖動。直到內部結冰全部溶解為止，約需50秒～100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。
【液氮超低溫保藏】
液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態氮，或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨於停止而有效地保藏微生物。
操作步驟如下：
1.安瓿管或凍存管的準備
用圓底硼硅玻璃製品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗乾淨，121℃下高壓滅菌15~20分鐘，備用。
2.保護劑的準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配製保護劑時，應注意其濃度，一般採用10～20%甘油。
3.微生物保藏物的準備
微生物不同的生理狀態對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養物。
分裝時注意應在無菌條件下操作。
菌種的準備可採用下列幾種方法：
刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻後加入凍存管內；
接種液體培養基，振盪培養後取菌懸液與保護劑混合分裝於凍存管內；
將培養物在平皿培養，形成菌落後，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5~10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻後加入凍存管內；
在小安瓿管中裝1.2～2毫升的瓊脂培養基，接種菌種，培養2～10天后，加入保護劑，待保藏。
4.預凍
預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。
目前常用的有三種控溫方法：
程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控制降溫速率。
分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛於冰的氣霧中逐漸降溫。一般採用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然後取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。
對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。
5.保藏
將安瓿管或塑料凍存管置於液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。
6.復甦方法
從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃~40℃水浴中快速復甦並適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒~100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。
試劑：
都是常用的試劑，一般正規生化試劑代理公司都有，質量上沒有大的問題。
