'非小細胞肺癌液體活檢技術研究進展'

作者：吳亮1，山順林2

單位：1.蚌埠醫學院臨床醫學系

2.解放軍82醫院腫瘤中心

原發性肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，其中80%～85%為非小細胞肺癌(NSCLC)。我國惡性腫瘤發病率及病死率佔第1位的均是肺癌。具有發病率高、發病機制複雜、早期難以發現，治療效果不佳等特點。腫瘤標誌物有助於早期診斷肺癌，對早發現、早診斷、早治療有重要作用。根據數據顯示，在初診時，57%的病人已出現遠處轉移，因此發現新的有價值的生物學標誌物檢測方法對於早期診斷肺癌，預測疾病發展，快速評估療效顯得十分重要。

穿刺活檢標本雖然能明確有無腫瘤及其類型，但是有創傷性，而且由於肺癌的位置和大小、腫瘤組織的異質性、活檢組織的滯後性，有不易反映腫瘤整體狀態，不易隨時監測，多次活檢依從性差等缺點。正是存在這些缺點，液體活檢技術在腫瘤的早期監測顯示出明顯的技術優勢，被MIT Technology Review(麻省理工科技評論)雜誌公佈為2015年度十大突破技術的榜單，液體活檢位列其中，成為當下研究熱門領域。液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術，具有無創傷性，標本容易獲得，可以反映腫瘤整體狀態，實現實時監測的優點，有助於腫瘤微轉移的早期發現和預後評估，在治療監測，個體化治療發揮重要價值。基於精準醫療已經成為腫瘤診療過程的熱點，液體活檢是指從體液中獲得來源組織的生物標誌物，並通過對所得標誌物分析來反映其來源組織相關信息。液體活檢項目包括循環腫瘤細胞(CTCs)、循環腫瘤DNA(ctD-NA)，外泌體(Exosomes)，小核糖核酸miRNA等，其中CTCs與ctDNA發展最為迅猛。目前液體活檢主要應用領域是腫瘤的血液檢測，即利用血液提示腫瘤發展進程及抗藥性等信息，指導個體化精準治療。

目前，CTCs、ctDNA和外泌體是現在最主流的液體活檢技術，表1對這三種技術做了簡單的歸納。

從技術角度上，隨著新一代的測序技術，ctDNA的檢測變得最為容易，也是液體活檢領域發展最快的分支，外泌體是本身理化性質的原因，分離難度最大，CTCs因為包含整個細胞的基因組、轉錄組、蛋白質組是液體活檢領域臨床研究最為深入。

1.CTCs

1.1 CTCs作為潛在標誌物的研究進展

CTC在1869年被澳大利亞病理學家John Ashworth發現，是指在實體腫瘤發生過程中，有少量的細胞從原生腫瘤脫離進入血液，隨血液循環到達新的定植器官，繼而形成新的轉移灶。1960年科學家發現多個CTC聚集在一起的CTC簇。而隨著1994年Cellsearch系統的研發成功，大量的臨床實驗展現了CTC在癌症預後復發效用上的應用。

目前CTCs是罕見的可以預測多種腫瘤預後的細胞，這些循環細胞通過不同技術進行檢測，其分析被稱為對病人的實時“液體活檢”。CTCs具有廣闊前景，在技術上仍然具有很大的挑戰性，尤其是關於CTC富集和分析技術，已先後出現膜過濾法、免疫熒光染色、RT-PCR等，這些技術的不斷革新提高了從海量血細胞中獲取CTC的準確度和對後續分析提供支持，也是這項技術的臨床應用成為可能。Dorsey等研究中指出在成功檢測CTCs數量的NSCLC病人中，放療後病人血清CTCs數量減少和腫塊的大小減小相一致，表明CTCs可以作為放療療效的評測指標。很多研究表明，很多腫瘤直徑即使在2～4mm的情況下已經有腫瘤細胞發生轉移進入血液循環，從這個角度，CTCs檢測技術對於腫瘤的早期診斷具有重要意義。研究通過Cellsearch技術檢測早期未發生轉移的腫瘤病人(根據腫瘤的類型)CTC細胞的比率非常低，利用同樣的技術，Ilie等對長期吸菸的慢性阻塞性肺疾病病人進行CTC細胞測定，定期複查最終診斷為肺癌的病人發現CTCs。CTCs對於腫瘤的早期診斷方面有至關重要的作用，在Fiorelli等的研究中，CTCs計數＞25可以幫助從良性病變病人中區分肺癌的異常肺部成像。

1.2 CTCs臨床應用進展

臨床分期是病人制定相關治療方案的依據。目前基於影像學檢測結果和通過腫瘤的病灶侵犯深度及淋巴結轉移情況來判斷病人的臨床分期，不能準確判斷腫瘤病灶血液微轉移情況對病人治療及預後的影響。液體活檢技術檢測CTCs可以很好地彌補這一缺陷，對病人的臨床分期做出有效的評估。Krebs等研究101例未經任何治療Ⅳ期NSCLC病人，發現治療前CTC計數水平與腫瘤分期具有顯著相關。Nicolazzo等對24例Ⅳ期NSCLC參與PD-1/PD-L1抑制劑治療的病人，發現CTCs及其PD-L1的表達與病人的不良反應結果相關。說明PD-L1陽性CTCs可能成為抗PD-1定向治療的預測性腫瘤標誌物。

1.3 CTCs的臨床侷限性

雖然CTCs技術已經表現出很強的診斷和預測腫瘤治療有效性的的作用，CTCs同時具有侷限性，CellSearch和其他的技術使用上皮組織標誌物並不能發現所有的CTCs，因此依賴單細胞測序技術的發展，同時腫瘤細胞具有異質性，CTCs細胞並不能完全代表實體腫瘤，這些問題都需要在臨床上亟待解決。

2.ctDNA

2.1 ctDNA作為潛在標誌物的研究進展

ctDNA是指腫瘤細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡後釋放進入循環系統，源於腫瘤細胞的雙鏈DNA，主要存在血液，滑膜腔積液，腦脊液等體液中，外周血遊離DNA的大小約為160～190 bp，其長度大約為50 nm。循環DNA的表現應該更具有特異性，隨著基因測序的飛速發展，目前，已能在血液中對其進行檢測並計數。它的發現追溯到循環遊離DNA(cfDNA)，cfDNA是由體細胞釋放入外周血循環後發生降解的內源性DNA。ctDNA可以通過多種方式進入血液中，比如:分泌、吞噬作用以及凋亡壞死。Qiu等研究發現ctDNA提供了一種微創和可行的方法檢測EGFR突變的NSCLC(NSCLC)。ctDNA的分析將是NSCLC個體化治療一個重要組成部分。Nie等指出，基因突變、基因甲基化等均可在NSCLC病人ctDNA中發現，ctDNA可以用來檢測NSCLC，同時對於腫瘤的異質性，ctDNA檢測腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性和特異性。Marchetti等從37例非小細胞癌病人中抽取血液樣本利用CellSearch系統結合二代測序技術(NGS)進行研究，檢測到ctDNA中EGFR基因突變和對應腫瘤組織檢測結果31例，提示液體活檢結果為病人EGFR基因突變產生併為病人提供個體化治療提供重要的參考依據。

2.2 ctDNA臨床應用進展

很多科學研究表明ctDNA可以準確預測病人的預後，美國約翰霍普金斯大學發明BEAMing擴增法，大大提高ctDNA的檢測敏感性。通過將循環DNA與磁珠結合進行計數，可以實現萬分之一的檢測靈敏度。此外數字化PCR技術也逐漸應用於ctDNA基因檢測。數字PCR技術是一種新型的高靈敏性的核酸片段分析技術。Chen等收集了58例早期NSCLC病人的配對血液和組織標本，採用靶向測序技術檢測配對的腫瘤血漿ctDNA標本的基因突變狀態，結果發現血漿檢測ctDNA突變狀態，與組織標本具有較高的一致性，且比不同腫瘤標誌物具有更高的敏感性。表明ctDNA可以作為判斷腫瘤的預測因子。Rosell等通過ctDNA分析180例晚期NSCLC病人的EGFR和KRAS的突變狀態，其中120例病人診斷時時分析ctDNA，而60例病人在出現對EGFR-TKIs耐藥性時分析了ctDNA。結果顯示對於發生轉移的病人而言，ctDNA分析是檢測EGFR和KRAS突變的有效方式。最新研究表明，ctDNA中腫瘤特異性突變和CTC計數相比，在判斷預後ctDNA方面展現非常明顯的優越性。

2.3 ctDNA的臨床侷限性

不同病人不同時間測定外周血中ctDNA水平差異很大，受清除速度、血容量、腫瘤的分期分級等因素影響較大。此外基於現代的檢測技術digital PCR，標記擴增深度測序技術、分光光度法提高靈敏性，血液標本中ctDNA量少，與腫瘤組織相比，可靠性穩定性尚需進一步驗證。

3.Exosomes

3.1 Exosomes作為潛在標誌物的研究進展

Exosomes來源廣泛，淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及上皮樣細胞、腫瘤細胞等都可以分泌外泌體。這些細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑約為40～100nm，具有典型的脂質雙分子層膜結構，其攜帶有母細胞多種蛋白質、脂類、DNA和RNA等重要信息，在細胞和細胞間的物質交換和信息傳遞起到重要作用。外泌體含有大量的蛋白質，主要分為兩類:一類是外泌體固定蛋白，另一類是與細胞來源和組織類型相關性的特異性蛋白。此外，外泌體含有大量的遺傳信息mRNA和miRNA，對外泌體研究最多的是具有功能活性的miRNA成分。最近的研究表明，這些外泌體可以作為標誌物，來檢測疾病的進展，甚至在病人出現臨床症狀前做出腫瘤診斷、預後判斷、療效評估。腫瘤來源的Exosomes促進腫瘤的生長，轉移和耐藥。目前對於外泌體的分離提純方法包括高速離心法，密度梯度離心法，色譜法，超濾膜過濾離心法等。NSCLC病人的Exosomes中包含的腫瘤相關蛋白有EGFR、KARS、claudins、RAB家族蛋白等。Alos等對8例化療前的NSCLC病人的外泌體進行電泳分析，發現NSCLC，發現出現特異性高表達的蛋白條帶，還發現NSCLC腫瘤組織中也存在該蛋白高表達，提示高表達的特異性蛋白條帶可能來源原發腫瘤組織，可作為NSCLC潛在的腫瘤標誌物。

3.2 Exosomes的生物學功能

肺癌發生和發展是一個多步驟的過程，涉及分子基因水平的變化，肺癌的發病過程仍有很多未解之處。NSCLC通過與腫瘤微環境相互作用介導腫瘤的增殖和侵襲。Al-Nedawi等發現NSCLC外泌體可將突變的EGFR轉移到腫瘤相關的血管內皮細胞，促進血管內皮生長因子的表達分泌，從而促進內皮細胞增殖。Wang等研究表明，NSCLC外泌體中的TGF-β和IF-10也參與調控細胞的增殖轉移，其高水平表達可促進腫瘤生長和轉移。Rahman等通過將具有侵襲性和不具有侵襲性的肺癌細胞外泌體分別作用於受體細胞進行對比研究，發現高度侵襲性肺癌外泌體可誘導受體細胞表達與腫瘤發生轉移密切相關的波形蛋白，並可能通過波形蛋白來驅動受體細胞發生上皮間質轉化，從而獲得侵襲和遷移能力。另外，NSCLC外泌體中的miRNA也廣泛參與NSCLC侵襲-轉移過程中的調控。

3.3 Exosomes的臨床侷限性

NSCLC外泌體的研究有重要的臨床意義，但是很多問題需要解決，外泌體的miRNA的表達受到很多因素影響，特異性和靈敏性不高，目前尚無標準的提純外泌體的方法，在分離和純化外泌體的過程還有很多問題需要進一步解決，腫瘤組織和外泌體的miRNA存在一定差異性。在臨床上不能廣泛的應用。

早期檢測是癌症研究和治療的關鍵，液體活檢是一項富有挑戰的新技術，在腫瘤的精準醫學中扮演越來越重要的角色，隨著檢測標準化的日益發展，檢測靈敏度的提高，以及新的生物標誌物的問世，液體活檢將成為最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效檢測手段，臨床應用價值極其顯著。大量研究進一步證實，液體活檢技術檢測在腫瘤細胞中數量與腫瘤發生、療效、轉移和預後有著密切的關係，通過外周血對腫瘤細胞的檢測，有助於腫瘤的早期診斷，療效的快速評估，個體化治療，預後判斷和腫瘤復發的監測。

隨著腫瘤基因組分型系統和精準治療的臨床廣泛應用和推廣，本文側重描寫了當前熱門的CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體技術在NSCLC中的研究進展，目前液體活檢行業仍處於早期階段，真正進入臨床但仍有很多問題亟待解決，著力開發高特異性和靈敏性的檢測技術是進一步臨床的前提，建立檢測標準，還需得到臨床實踐的認可，在檢測技術不斷創新的同時，相信液體活檢技術會成為未來精準醫學趨勢。

節選自：安徽醫藥 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2019 Jul，23(7)