本文原載於《中華結核和呼吸雜誌》2018年第12期
本文作者：刁文琦 徐明 賀蓓
近年來，微生物組學的迅猛發展，擴寬了我們對呼吸道病原學的理解。相對於傳統的細菌培養，新一代的測序技術能夠在同一標本中同時檢測到上千種不同類型的細菌且不依賴於培養[1]。呼吸領域的研究者已經將這些技術應用於檢測正常及呼吸系統疾病的肺或氣道標本，包括慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）、支氣管哮喘（哮喘）及囊性纖維化等[2,3,4]。這些結果已經改變了我們對呼吸道病原學的認知，比如在正常人的肺泡灌洗液及肺組織中可檢測到微生物，其可能來源為口咽部菌群的遷移及空氣吸入[5,6]。這些研究結果提示，下氣道並不是絕對無菌，挑戰了傳統的認知。
大約只有15%的吸菸者最終會發展為慢阻肺患者，而且相當比例的慢阻肺患者雖戒菸但氣道炎症依然存在，這些證據都提示存在某些因素放大了菸草的作用[7,8]。最近5年來大量的微生物組學研究已經更新了我們對慢阻肺患者氣道微生物的認知，這些研究結果提示即使在慢阻肺患者的非急性加重期，在痰及其他呼吸道標本中的流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌及肺炎鏈球菌數量也常常增加，這表明呼吸道菌群可能參與了慢阻肺的發生發展[9,10]。當前呼吸道微生物組學主要關注的是細菌，而真菌及病毒的研究非常少。因此，筆者在此僅探討細菌微生物組學的研究進展，以期大家能從中獲益，更好地理解慢阻肺的病原學特徵。
一、微生物組學研究方法
目前存在多種微生物組學研究方法，各有所長，但仍以16SrDNA焦磷酸測序研究為主。
1．主要測序平臺：
當前微生物組學主要依賴於高通量的分子生物學技術，而不依賴於細菌培養，主要包括2類測序技術，一是針對細菌基因組的16S核糖核苷酸（ribosomal ribonucleic acid, rRNA）進行焦磷酸測序；二是針對細菌全基因組進行測序，也稱為宏基因組學。（1）16SrRNA基因為細菌的管家基因，既包括高度保守的區域，又包括9個可變區，因此可用於細菌的分類及進化分析[11]。當前16S焦磷酸測序主要利用通用引物針對這一區域的不同部位使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）進行擴增，進而執行後續的測序及分析[12]。主流的測序平臺包括羅氏454及illumina公司的Miseq或HiSeq測序平臺。由於illumina平臺是雙端測序且測序深度優於454平臺，因此其已經作為當前測序的主流。Illumina平臺的缺點是讀長較短，僅能檢測到16SrRNA基因的部分區域，限制其對細菌分類的準確性。第3代測序技術如PacBio具備更長的讀長，可以檢測到16SrRNA基因區域的全長，期待可以更好地幫助微生物組學研究。（2）宏基因組學可以檢測細菌基因組的全長而不僅僅針對於16SrDNA基因區域，因此可以檢測到細菌基因組的功能域，可以更加有效地分析細菌對宿主的影響，但由於呼吸道標本中微生物含量很低，受到大量宿主細胞的干擾，因此應用嚴重受限[3]。
2．生物信息學的分析方法：
當前呼吸道微生物組學的主流依然是16SrDNA焦磷酸測序，其主流的分析平臺包括QIIME、Mothur及Usearch[13,14,15]。這些軟件的算法核心是將相似度>97%的序列聚類成結構分類單元（operational taxonomic units，OTU），然後與核糖體數據庫（ribosomal database project, RDP）、Greengene或SILVA數據庫進行比對，最終鑑定到屬或種水平。宏基因組學的數據量遠遠高於16SrDNA焦磷酸測序，需要與整個細菌基因組序列進行比對，目前主流的分析方案是基於MG-RAST[16]。後續的多元統計主要涉及α多樣性及β多樣性。α多樣性主要反映的是單獨樣本內物種的多樣性，計算方法主要有chao1、shannon和simptom等。β多樣性依賴於距離矩陣，主要包括Bray-Curtis、Jaccard及Unifrac等。這些距離矩陣將被用於進行後續的主座標軸分析或其他多元統計。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）、深度學習或共表達網絡分析主要用於篩選核心細菌，並分析這些細菌與疾病進展的關聯。
二、呼吸道微生物組學特點
穩定期慢阻肺患者氣道內菌群多樣性較正常人降低，鏈球菌屬、普氏菌屬（Prevotella)、莫拉菌屬及嗜血桿菌屬可能佔據主體地位。
最早的呼吸道微生物組學研究始於2010年，Hilty等[17]經毛刷獲取支氣管刷檢標本，發現慢阻肺患者的嗜血桿菌屬的比例較非慢阻肺對照顯著升高，而普氏菌屬則明顯下降。Erb-Downward等[6]採集灌洗液及肺組織標本發現不同程度的慢阻肺患者之間微生物的總量相似，但多樣性會減低，假單胞菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、梭菌屬及嗜血桿菌屬是常見的下呼吸道細菌。Garcia-Nuñez等[18]、Diao等[19]及Wang等[20]分別在慢阻肺患者痰及咽試紙標本中發現菌群多樣性降低的表現。Cabrera-Rubio等[21]檢測同一組慢阻肺患者的痰標本、呼吸道吸取物、灌洗液及氣道黏膜活檢標本的細菌分類，發現數量依次為鏈球菌屬、普氏菌屬、莫拉菌屬及嗜血桿菌屬等。Aguirre等[22]發現在穩定期患者中使用微生物組學測序常檢出嗜血桿菌屬及莫拉菌屬，但在傳統培養中陽性率較低。因此有學者推測這些細菌在急性加重之前已經定植於慢阻肺患者的下呼吸道中，很可能來源於口咽部的菌群[5]。國內研究結果表明慢阻肺患者咽部的菌群不同於正常人，以鏈球菌的變化最為顯著，與下呼吸道的改變類似，支持口咽部菌群向下呼吸道遷移假設[19]。Sze等[23]發現隨著肺氣腫的加重、終末支氣管代償性增多及CD4+T細胞在肺組織中的浸潤增加，肺部菌群的多樣性會相應減少；同時還觀察到流感嗜血桿菌的缺失與終末氣道數量的增加有關。Erb-Downward等[6]報道在不同部位（左上、下肺及右上、中、下肺）的肺組織標本中，菌群的分佈也不盡相同，認為肺泡結構的嚴重破壞可能會影響部分細菌的生存環境，使其多樣性減少，而這些減少的細菌（如流感嗜血桿菌）可能遷移到氣道中生存；免疫細胞的增加可能是機體對肺部菌群改變的反應性調控，部分細菌無法適應這種免疫改變而被淘汰，如黃桿菌屬隨著CD4+T細胞的增加而減少[23]。但這些假設仍需要更多的研究證明其因果關係。此外，Pragman等[24]發現在吸入性激素使用者的灌洗液中其菌群構成與未使用者不同，但未觀察到鏈球菌屬、普氏菌屬、莫拉菌屬及嗜血桿菌屬的改變，改變的多為一些少見的低丰度細菌（如丙酸屬、梭菌屬等）。總之，通過這些研究結果可以發現，雖然患者間氣道微生物菌群的構成差異很大，但鏈球菌屬、普氏菌屬、莫拉菌屬及嗜血桿菌屬在氣道菌群中可能佔據主體地位，慢阻肺患者氣道及肺部菌群的多樣性常常降低，其構成可能會受到肺部結構改變、免疫調節及治療干預的影響。
三、慢阻肺急性加重與氣道微環境的關係
慢阻肺急性加重的過程不是僅由一種或幾種細菌所決定，更可能是氣道微環境與菌群失衡的結果。患者在急性加重期呼吸道症狀顯著增加，急性加重與患者整體預後密切相關。既往認為細菌或病毒載量與急性加重的發生密切相關，而且流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌及卡他莫拉菌在急性加重期患者的痰培養中常呈陽性[9,10]。當前微生物組學的證據顯示，僅部分患者在急性加重期表現為流感嗜血桿菌或卡他莫拉菌的數量顯著升高，而更多的個體僅呈現微弱的增加甚至減少[20,25,26]。這表明急性加重期的病原學變化具有個體化特徵，不僅僅是由一種或幾種細菌所引起。Wang等[20]認為這可能與急性加重類型有關，與嗜酸粒細胞增多的急性加重相比，流感嗜血桿菌及卡他莫拉菌在細菌型急性加重中拷貝數增加的更明顯。Molyneaux等[25]發現鼻病毒感染可以造成慢阻肺患者痰細菌總量、中性粒細胞數量及相關炎症因子水平顯著升高，其中尤以流感嗜血桿菌增加最為明顯，但正常對照受試者則不受影響，這提示病毒入侵可能作為始動因素破壞氣道微環境，使之適應某些細菌的增長，如流感嗜血桿菌。但也有學者指出，儘管均為流感嗜血桿菌的增加，但增加的細菌在分類學上可能與之前存在於氣道中的細菌並不同[27]，因此也可能是外源性感染了同類別的細菌而不是固有定植菌的過度增加。流感嗜血桿菌在分類學上屬於丙型變形菌綱的巴斯德菌科，Huang等[26]發現與其分類學上高度相似的細菌（巴斯德菌科或丙型變形菌綱的其他科）在急性加重期是協同變化的，而與其在分類學上較遠的細菌（如芽胞桿菌科、葡萄球菌科等）則呈相反的變化。這與菌群在腸道的表現是一致的，我們稱其為"菌以類聚"。以上結果提示即使是入侵的外源性細菌，也很可能是與氣道固有的常見定植菌在分類學上高度相似的細菌。Millares等[28]發現穩定期銅綠假單胞菌的感染並不影響急性加重期痰部菌群的變化，此外,他們還發現急性加重期痰部菌群碳水化合物的合成會增加。
急性加重期全身糖皮質激素（激素）或抗菌藥物的使用對氣道菌群的影響是另一個值得關注的問題。Huang等[26]發現系統性激素或抗菌藥物的短時程使用對呼吸道菌群卻是一個持久的影響，可達數週甚至數月；激素會持續性增加細菌的載量，而抗菌藥物則會產生持久的抑制，尤以變形菌門的變化最為明顯。另1項大型隨訪的研究結果也確認了這一發現[20]。Slater等[29]報道阿奇黴素可以改變哮喘患者菌群的構成，包括了常見致病菌的減少，如假單胞菌屬、嗜血桿菌屬及葡萄球菌屬。一項大型臨床研究結果表明，長期使用阿奇黴素可有效地減少慢阻肺急性加重的次數[30]。這些證據菌提示大環內酯類抗菌藥物可能不僅僅針對細菌本身，而有可能重塑整個氣道的微環境，比如減少呼吸道炎症，但相關報道仍然缺乏。
總之，通過以上研究結果，目前認為慢阻肺急性加重的過程不是僅由幾個細菌所決定，更可能是氣道微環境與菌群失衡的結果[3,4]，這種微環境的失衡可能與宿主免疫狀態、病原體的入侵（細菌或病毒）及治療干預密切相關（表1）。
表1 慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）相關微生物組學研究總結
四、展望及總結
當前16SrDNA焦磷酸測序為呼吸領域主流的測序技術，但受限於技術本身並不能夠揭示不同細菌間的相互作用，比如我們關注的卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌及肺炎鏈球菌是否通過某些信號分子而進行"感知"。由於宏基因組及宏轉錄組能檢測到細菌的功能區[31]，因此可以幫助我們探究細菌是否通過特定基因的表達產生信號分子而與其他細菌進行"交流"，並認識這種信號傳遞如何促進慢阻肺的發生發展。肺腸軸是另一個熱點問題，Dickson等[12]已經發現急性呼吸窘迫綜合徵的患者腸道菌群可以遷移到肺部。慢阻肺是一種以肺部炎症為主的全身炎症性疾病，因此呼吸道及腸黏膜的通透性均可能增加，這也為肺腸菌群的遷移或"交流"提供了可能，這些問題可能會成為今後呼吸道菌群研究的熱點。
總之，呼吸道菌群在不同個體間存在很大的變異，這是因為其形成是與氣道微環境動態平衡的結果。氣道或肺結構的改變、免疫狀態、治療干預及病原體（細菌或病毒）的入侵均可能改變這種平衡。從單個細菌的層面來說，菌群的研究結果支持嗜血桿菌屬、莫拉菌屬及鏈球菌屬在穩定期及急性加重期均為主要菌群，但其他與此同源的細菌也可能參與到疾病的進程。期待更多高質量的菌群研究能夠更好地幫助我們重新認識感染與慢阻肺的關係，為臨床實踐提供指導。
（參考文獻）
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