生物極客導讀
Church 近期在起實驗室網站上公佈了一份手稿，來自大名鼎鼎的Editas Medicine的首席技術官Vic E. Myer與著名科學家GM Church聯合發文
“The experimental design and data interpretation in “Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo” by Schaefer et al. are insufficient to support the conclusions drawn by the authors”
Schaefer等人在“體內CRISPR-Cas9編輯後意外突變”中的實驗設計和數據解釋。不足以支持作者得出的結論，詳細剖析了近期Schaefer等人在Nature Methods上發表的文章。質疑相應的實驗設計與數據的可靠性。
文章全文詳情：
編輯：
Schaefer自然方法最近的信函已經獲得了極大的關注，他們所得出的重磅結論與現有的使用類似的分析方法的許多文章相反，作者認為，CRISPR-Cas9系統在不被gRNA靶向的基因組區域中具有高度誘變性。 我們認為，從這項研究得出的結論，由於所設計和實施的實驗所揭示的結論並不成立。 此外，不可能將觀察到的受試小鼠的差異歸因於CRISPR本身的作用。 在比較分析中看到的遺傳差異可能在CRISPR編輯之前存在。
在我們看來，Schaefer等人的實驗，觀察和隨後的結論可以歸納如下。使用基於CRISPR的基因組編輯在受精卵階段創建的兩隻小鼠與單一的“共同安置的無CRISPR介導的校正的FVB / NJ小鼠”相比，顯示出在整個基因組大量單核苷酸變體（SNV）和插入和缺失（ indels）。兩個獨立產生的CRISPR編輯的小鼠共有的突變數為1,397個SNV和117個插入片段。令人驚訝的是，這些明顯的突變全部來自基因組中與gRNA的同源性差（在5％-65％之間）的序列。此外，50個最接近，預測的脫靶位點（基於gRNA序列同源性）中沒有一個具有任何觀察到的活性（SNV或indel）。作者推測，存在一個未報告的活動，其中“某些sgRNA可能在體內獨立於其靶標靶向基因座”。
我們認為，從本研究得出的結論不被揭示的實驗所證實，並且不可能將觀察到的受試小鼠的差異歸因於CRISPR本身的影響是基於以下觀察結果：
首先，研究對象的總數很低（n = 2個處理的小鼠，n = 1個未處理的小鼠），並且施用於經處理和未處理的小鼠的測序深度不相等。 試圖瞭解科學觀察的統計重現性和可靠性時，數據不充分的研究可能會成為限制性的。
其次，選擇共同宿主的小鼠（與父母或真正的同窩同胞相反）作為對照不足以將觀察到的治療小鼠和對照小鼠之間的差異歸因於CRISPR。 實驗的設計使得作者不可能排除實驗動物和單個對照之間報告的基因組差異在CRISPR實驗操作之前存在的可能性。 事實上，出版的文獻顯示，同窩同胞基因組的差異通過全基因組測序（WGS）分析可以顯著（985個SNVs被鑑定）。 這些差異歸因於在繁殖群體內由正常孟德爾遺傳傳播的突變。 在Oey等人中，通過測序方法對父母的進一步分析證實，這些SNV中絕大多數存在於父母中，少部分出現在後代的單獨變異。
為了控制近交系小鼠在核苷酸水平上不完全相同的現實，適當控制的實驗將包括必需組分，例如：1）母本動物的測序以確定進入實驗的輸入基因組序列，2）育種使用CRISPR編輯的小鼠去除嵌合體，以及3）使用相同的方法從相同的實驗方案產生和表徵小鼠，但缺少關鍵的個體成分，以排除方法本身是誘變的可能性。應將與質粒（編碼sgRNA）+單鏈DNA寡核苷酸（ssODN）供體DNA + Cas9蛋白質產生的小鼠與用質粒+ ssODN供體，質粒+ Cas9蛋白和ssODN供體+ Cas9蛋白質產生的小鼠進行比較。這可以控制這些成分中的任一個單獨地或產生小鼠的過程本質上是致突變的可能性。類似的研究已經在同一期刊上發表，使用適當的對照，並發現顯著降低的SNV和indels表明實驗差異，而不是CRISPR，可能是Schaefer等人最近觀察到的原因。
此外，我們將強調Schaefer等人報道的以下觀察結果。
當通過gRNA特異性預測算法運行時，在所公開的實驗中使用的具體gRNA顯示出對目標的高傾向，通過1個核苷酸匹配鑑定1個不同於小鼠基因組的脫靶位點，1個不同靶位點通過2個核苷酸匹配的小鼠基因組和通過3個核苷酸匹配與小鼠基因組不同的24個脫靶位點。雖然可能為研究目的而接受，但具有預測的高脫靶細胞譜的gRNA將被立即排除作為治療候選物。儘管目標活動的高傾向性，我們發現令人驚訝的是，這種gRNA使用本研究中使用的方法，沒有顯示任何預測的脫靶，這強調了經驗地預測和測試脫靶活性的重要性。
儘管認為SNV是在單獨的合子中產生的，但在兩個CRISPR編輯的小鼠中發現的大多數外顯子SNV不僅在這些小鼠之間共享，而且在位置和核苷酸組成中也表現出相同的核苷酸變化。此外，儘管這些是馬賽克動物，但“正常”至“突變體”等位基因計數比幾乎相同。兩種動物在相同基因組位置處的相同核苷酸變化是純合的或雜合的。這強烈地表明絕大多數這些突變存在於原始動物中。在幾乎每種情況下，完全相同基因完全相同基因完全相同位置發生的確切核苷酸變化的機率實際上為零。
總之，我們的觀點是，作者沒有充分控制研究，以這樣一種方式可以得出結論，CRISPR誘導觀察到的突變。 在我們看來，在比較分析中看到的遺傳差異可能在用CRISPR編輯之前存在。 我們鼓勵作者對適當控制的實驗進行跟蹤，因為理解和控制CRISPR技術的特異性對研究至關重要，對治療發展至關重要。 我們堅定地致力於嚴格，客觀和全面地評估我們自己的工作中的特異性，並提出在如何最佳評估這一關鍵參數方面的共同理解，將基於CRISPR的藥物引入基因定義或 遺傳可治療疾病。
Authors:
Anne Bothmer1 Morgan L. Maeder1 Deepak Reyon1 Christopher J. Wilson1 Cecilia Cotta-Ramusino1 Cecilia A. Fernandez1 Eugenio Marco1
Luis A. Barrera1 Hariharan Jayaram1 Charles F. Albright1 Gerald F. Cox1 George M. Church2 Vic E. Myer1,3
1.Editas Medicine, 11 Hurley Street, Cambridge, MA 02141
2.Harvard Medical School, Boston, MA, USA
3.Corresponding Author
