淚腺作為潛在人免疫缺陷病毒儲存庫的分子機制研究

劉子揚 劉小偉 葉俊傑 韓揚 霍真

作者單位：100730 北京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院眼科(劉子揚、劉小偉、葉俊傑)，感染科(韓揚)，病理科(霍真)

通信作者：葉俊傑，Email: [email protected]；韓揚，Email: [email protected]

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.05.005

【摘要】 背景 獲得性免疫缺陷綜合徵（AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的以全身免疫系統嚴重損害為特徵的感染性疾病，目前主要的治療方法是高效抗逆轉錄病毒療法（HAART），但不能徹底清除患者體內的免疫缺陷病毒（HIV），目前認為是病毒潛伏於HIV儲存庫所致。研究證實HAART治療後患者血漿中HIV載量檢測陰性的AIDS患者的淚液中發現了HIV，因此探索其眼部儲存庫是非常重要的。 目的 探討淚腺組織是否具有HIV儲存庫的分子基礎以及HIV感染淚腺組織的發生機制。方法 收集2013年11月至2015年12月在北京協和醫院因淚腺良性疾病行淚腺手術獲得的淚腺組織標本14例，其中13例來自於HIV陰性患者，1例來自於HIV陽性患者。13例HIV陰性患者臨床診斷為淚腺脫垂者9例和淚腺炎者4例，病理診斷為正常淚腺組織者12例和淚腺間質淋巴組織增生者1例。 HIV陽性患者的臨床診斷為淚腺炎，病理診斷為淚腺間質淋巴組織增生。將12例HIV陰性和1例HIV陽性患者的淚腺組織標本用石蠟固定切片，採用免疫組織化學法檢測淚腺標本中HIV受體CD4及CXC趨化因子受體4（CXCR4）和CC趨化因子受體5（CCR5）分子的表達；1例HIV陰性患者的淚腺組織標本製備成新鮮冰凍切片，採用免疫熒光染色對淚腺標本中CD4及CXCR4和CCR5分子的表達進行驗證。 結果 免疫組織化學染色顯示，HIV陰性患者淚腺組織CD4分子染色背景強，為可疑陽性表達；各例標本中多數淚腺上皮細胞可見CXCR4表達，定位於細胞質和細胞核，少數淚腺上皮細胞不表達CXCR4；在各例標本中少數淚腺上皮細胞中CCR5呈局灶陽性表達，主要位於細胞質和細胞核，多數淚腺上皮細胞不表達CCR5。HIV陽性患者淚腺組織中CD4分子染色背景強，為可疑陽性表達；CXCR4及CCR5在淚腺上皮細胞中為陽性表達；間質組織中可見大量散在淋巴細胞，其CD4、CXCR4及CCR5均為陽性表達。免疫熒光染色顯示，HIV陰性患者淚腺組織中CD4、CXCR4、CCR5均呈紅色熒光，CD4呈線狀及片狀分佈，主要定位於淚腺上皮細胞的細胞膜，而CXCR4和CCR5則呈現散在點狀分佈，定位於淚腺上皮細胞的細胞質。結論 HIV相關分子受體CD4及其輔助受體CXCR4、CCR5在淚腺上皮細胞均呈陽性表達，淚腺上皮細胞具有受到HIV感染和成為HIV儲存庫的分子基礎。

【關鍵詞】 獲得性免疫缺陷綜合徵/免疫學；艾滋病相關眼病/代謝；人免疫缺陷病毒感染/代謝；病毒潛伏；淚液/病毒學；CD4+ T淋巴細胞受體/病毒學；CXCR4受體/代謝；CCR5受體/代謝；淚腺上皮細胞

基金項目：國家自然科學基金項目（81371758）

獲得性免疫缺陷綜合徵（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的以全身免疫系統嚴重損害為特徵的感染性疾病。HIV通過其表面糖蛋白gp120與靶細胞表面蛋白的CD4結合並在CXC趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）和CC趨化因子受體5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）的幫助下進入人體細胞引起感染，造成CD4+T淋巴細胞數量進行性減少和細胞免疫功能損害，最後導致各種機會性感染和腫瘤的發生[1]。高效抗逆轉錄病毒療法（high active antiretroviral therapy，HAART），即雞尾酒療法，是治療AIDS最有效的方法。HAART可使患者血漿中HIV RNA水平下降乃至無法檢出（<50拷貝數/ml），但不能徹底清除患者體內的HIV病毒，且突然中止HAART治療可導致外周血中病毒載量迅速反跳[2-4]，病毒載量反跳主要來自於全身HIV儲存庫中釋放的HIV。靜息狀態下，HIV病毒以低轉錄水平潛伏在HIV儲存庫中，一定刺激下被激活並重新進行病毒複製[5-7]，導致疾病復發。因此，HIV病毒儲存庫是HAART無法將患者體內病毒徹底清除的主要原因。目前，HIV儲存庫分為細胞儲存庫和解剖學儲存庫[7-9]，CD4+T淋巴細胞是HIV感染的主要靶細胞，雖然HIV感染CD4+T淋巴細胞後可導致細胞死亡[10-11]，仍有一些細胞轉變為休眠的記憶細胞，HIV前病毒可在記憶細胞中整合為完整的基因組[12]。中央和遷移的記憶CD4+T淋巴細胞是HIV的主要細胞儲存庫[8]，單核細胞和巨噬細胞也是HIV的細胞儲存庫[7,13]，其他的細胞儲存庫包括自然殺傷細胞、星形細胞、腎小管上皮細胞和胸腺細胞[14-16]。解剖學儲存庫主要為淋巴結、脾臟、腸相關淋巴組織、生殖器官、中樞神經系統和肺臟[17-19]。我們前期的研究首次報道了在HAART治療有效的AIDS患者淚液中發現了HIV病毒[20]，由於淚液主要來自於淚腺上皮細胞，由此推測淚腺可能為HIV的潛在儲存庫。本研究擬通過分析淚腺上皮細胞中HIV感染相關分子CD4及其受體CXCR4和CCR5的表達，從分子水平探討淚腺組織在HIV感染中的作用及其機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 人淚腺組織標本 於2013年11月至2015年12月收集在北京協和醫院眼科診斷為淚腺良性相關疾病並接受淚腺部分切除手術患者的14例淚腺標本，包括HIV陰性患者標本13例和HIV陽性患者標本1例。13例HIV陰性患者中臨床診斷為淚腺脫垂9例和淚腺炎4例，病理診斷為正常淚腺12例和淚腺間質淋巴組織增生1例。HIV陽性患者臨床診斷為淚腺炎，病理診斷為淚腺間質淋巴組織增生。

1.1.2 主要試劑 CD4兔多克隆抗體（NBP1-19371，1:100）、CCR5鼠單克隆抗體（NBP2-44483，1:100）（美國Novus Biologicals）；CXCR4兔單克隆抗體（ab124824，1:50，英國Abcam）；Dylight 649羊抗鼠抗體（BS10033）、Dylight 649羊抗兔抗體（BS10034）（中國Bioworld）；Fluoromount G熒光封片劑（美國Southern Biotech公司）；Zeiss LSM 510 system（德國Zeiss公司）。

1.2方法

1.2.1 免疫組織化學染色法檢測淚腺標本中CD4、CXCR4和CCR5的表達 將組織切片置於60 ℃恆溫烘箱中烤片1 h或68 ℃烤片20 min，然後將組織切片迅速放入二甲苯中浸泡脫蠟3次，每次3 min，脫蠟後的組織切片依次置於體積分數100%、85%、75%的梯度乙醇中浸泡各3 min，蒸餾水浸泡3次水化，每次3 min，將切片浸入200 ml 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩衝液的燒杯中，用保鮮膜覆蓋，微波高火加熱至沸騰進行抗原修復，然後調至解凍溫度加熱12 min，室溫冷卻；將切片置於蒸餾水中浸泡3次，每次3 min；置於體積分數3% H2O2中浸泡10 min以消除內源性過氧化物酶，蒸餾水中浸泡3 min，1倍PBS浸泡2次，每次3 min；滴加100 μl體積分數10%羊血清，置於溼盒中室溫封閉抗原10 min。輕輕甩掉羊血清，吸水紙小心吸乾殘留血清，滴加100 μl 相應一抗稀釋液，置於溼盒中4 ℃孵育過夜；將切片置於1倍PBS中浸泡3次，每次3 min；輕輕甩掉PBS，吸水紙小心吸乾殘留PBS，滴加100 μl相應二抗稀釋液，溼盒中37 ℃孵育30 min，將切片置於1倍PBS中浸泡3次，每次3 min；滴加100 μl 稀釋DAB顯色液，光學顯微鏡下觀察。染色結束後自來水沖洗，蘇木素染色3 min，自來水沖洗後置於體積分數1%鹽酸乙醇中浸泡，分化多餘的蘇木素，自來水沖洗，切片置於淡氨水中浸泡3 min返藍，自來水沖洗；分別置於75%、85%、100%的梯度乙醇中浸泡各3 min進行脫水，二甲苯中浸泡透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫熒光染色法檢測淚腺標本中CD4、CXCR4和CCR5的表達 淚腺組織冰凍切片於室溫環境下晾乾，滴加山羊血清抗體（non-specific IgG）室溫下封閉30 min，PBS沖洗3遍；滴加相應一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，PBS清洗3遍；滴加相應二抗稀釋液，37 ℃孵育2 h；PBS清洗3遍；滴加Fluoromount G防止熒光淬滅，蓋上蓋玻片，指甲油封片；熒光顯微鏡下觀察並分析。

2結 果

2.1免疫組織化學法檢測患者淚腺組織中CD4、CXCR4和CCR5的表達

2.1.1 HIV陰性患者淚腺組織中CD4、CXCR4和CCR5的表達 免疫組織化學染色顯示HIV陰性患者淚腺組織中CD4分子染色背景強，均為棕黃色染色，為可疑陽性表達（圖1A）；各標本中，多數淚腺上皮細胞中可見CXCR4表達，定位於細胞質和細胞核，呈棕黃色染色，少數淚腺上皮細胞未見CXCR4表達（圖1B）；各例標本的少數淚腺上皮細胞可見CCR5局灶表達，定位於細胞質和細胞核，呈棕黃色染色，多數淚腺上皮細胞未見CCR5表達（圖1C）。

2.1.2 HIV陽性患者淚腺組織中CD4、CXCR4及CCR5的表達 免疫組織化學染色顯示，HIV陽性患者淚腺上皮細胞中CD4呈陽性表達，定位於細胞膜、細胞質和細胞核，均呈棕黃色染色；CXCR4表達於淚腺組織上皮細胞的細胞膜；CCR5在淚腺組織上皮細胞中呈陽性表達，定位於細胞膜及部分細胞核（圖2）；同時可見淚腺組織中的間質淋巴細胞陽性表達。

2.2患者淚腺組織中CD4、CXCR4、CCR5表達的免疫熒光鑑定

免疫熒光染色顯示，CD4、CXCR4、CCR5均呈紅色熒光，CD4在淚腺組織中呈線狀及片狀分佈，多定位於淚腺上皮細胞的細胞膜（圖3A），而CXCR4和CCR5則呈點狀分佈，定位於淚腺上皮細胞的細胞質中（圖3B，C）。

3討 論

病毒儲存庫特指某些類型的能夠潛伏病毒的細胞群，病毒潛伏後仍具有複製能力和穩定的動力學特性。HAART治療AIDS體系的建立旨在徹底清除體內病毒，但目前發現潛伏於病毒儲存庫的病毒無法得以清除[21]，一旦條件適當，病毒即可恢復複製能力。接受HAART治療的AIDS患者外周血中HIV消退的動力學變化受治療起始時感染狀態及分期影響[7,10,22-23]。有關慢性感染期患者接受HAART治療的縱向研究表明，患者體內病毒儲存庫的半衰期超過44個月，這提示我們即使接受60年的HAART治療亦不能完全清除病毒儲存庫[24-25]。非血液性內環境的繁殖或複製可能是長期HAART仍無法有效治癒HIV的原因，因而想要完全清除病毒必須清除病毒儲存庫。

近年來相關研究技術的不斷進步使得人體內越來越多的HIV儲存庫被發現。除了靜止的記憶CD4+T淋巴細胞外，巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞都可以成為HIV的潛伏細胞群[26]。解剖學上的HIV-1潛伏病毒庫主要有淋巴結、中樞神經系統、骨髓、生殖道等[27]，一項關於HIV子宮內垂直傳播的途徑的研究表明，CXCR4蛋白定位於滋養細胞，而CCR5蛋白定位於絨毛基質中[28]。劉蕾等[29]應用原位PCR法檢測了9例AIDS患者腎臟組織中HIV的表達和定位，發現HIV-DNA主要表達於腎小管上皮細胞的細胞核和細胞質，提示HIV可直接感染腎臟組織而造成腎臟損傷。Jonathan等[30]對HIV相關腎病患者的腎臟穿刺組織進行檢查，發現腎臟可能是HIV病毒的儲存庫，即便是患者得到了HAART的有效治療且血漿HIV檢測已完全轉為陰性結果之後，腎小管上皮細胞和腎小球足突細胞內仍可發現HIV mRNA的陽性表達，其表達量與治療前比較無明顯變化。但也有些學者認為，檢測到HIV mRNA表達並不能確定為有腎臟局部的有效感染，而CXCR4、CCR5等受體的表達才是證明腎臟HIV感染的標誌[31]。有研究證實，CD4分子不表達於星形膠質細胞，但表達受體CXCR4和CCR5，星形膠質細胞是病毒儲存庫，但並不參與病毒複製，只有當外部條件改變時才誘導病毒的複製[32]。近期有研究表明星形膠質細胞可能通過縫隙連接傳播HIV[33-34]。

本研究發現，HIV檢測陰性患者的淚腺上皮細胞中CD4為可疑陽性表達，CXCR4可在多數淚腺上皮細胞中表達，而CCR5僅在少數淚腺上皮細胞中呈局灶可疑表達，淚腺上皮細胞間質組織中散在的淋巴細胞中均可見CD4、CXCR4及CCR5的陽性表達；而在HIV檢測陽性患者的淚腺上皮細胞中CD4可疑陽性表達，CXCR4及CCR5均為陽性表達，淚腺間質組織中可見大量散在的淋巴細胞，其CD4、CXCR4及CCR5均為陽性表達。儘管細胞不表達CD4，也不能排除HIV感染的可能，且HIV陽性患者淚腺上皮細胞CXCR4和CCR5的表達強於HIV陰性患者，提示CXCR4和CCR5的表達上調更有利於HIV對淚腺上皮細胞的直接感染。此外為了進一步明確CD4、CXCR4、CCR5分子在淚腺組織的表達情況，本研究中採用免疫熒光技術對HIV陰性患者淚腺組織中3種分子的表達進行鑑定，發現CD4、CXCR4、CCR5均在淚腺組織中表達，但CD4多集中於淚腺上皮細胞膜，呈線狀及片狀分佈，而CXCR4和CCR5存在於淚腺上皮細胞的細胞膜和細胞質，呈點狀分佈，證實淚腺上皮細胞具有受HIV感染的客觀條件。本研究認為人淚腺上皮細胞可通過細胞表面的CD4分子及其輔助受體CXCR4或CCR5感染HIV，或直接通過淚腺上皮細胞表面輔助受體CXCR4或CCR5感染淚腺上皮細胞，也可以通過淚腺上皮細胞與相鄰的HIV陽性的淋巴細胞以細胞介導的方式侵入，並感染CXCR4或CCR5陽性的淚腺上皮靶細胞。

綜上所述，本研究顯示淚腺上皮細胞具有HIV感染的分子基礎，其感染方式呈現多樣化，為進一步確定淚腺是HIV的儲存庫提供了可靠的實驗室證據，在HIV感染的防治方面具有重要的臨床意義。

參考文獻略

來源：選自醫學空間戰略合作伙伴《中華實驗眼科雜誌》, 2017, 35(5):410-415，轉載請標明出處！

醫學空間-讓連接有價值

四大主版塊：MS.TV，醫學文獻，行業資訊，醫友圈