應用熒光免疫層析法檢測H7亞型禽流感病毒

摘要

為了驗證熒光免疫層析法檢測H7亞型禽流感病毒的可行性，採用熒光免疫層析法分別對標準抗原和臨床樣品進行檢測，評價該方法的特異性、敏感性、穩定性和方法的適用性。結果為H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能夠檢出H7N9、H7N2亞型禽流感抗原陽性，對其他抗原檢測結果為陰性；能檢出H7N9、H7N2亞型禽流感病毒抗原（血凝效價1:512）1000倍的稀釋度；檢測10次H7N9亞型禽流感抗原的變異係數為1.12%，差異不顯著；檢測臨床100份樣品結果均為陰性。結果表明，應用熒光免疫層析法檢測H7亞型禽流感病毒操作簡便、試驗時間短和不受人為因素干擾，適合市場、養殖場大規模的監測或檢疫。

關鍵詞

熒光免疫層析法　H7亞型禽流感病毒　檢測　驗證

禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的高度接觸性傳染病。AIV屬於正黏病毒科甲型流感病毒屬，病毒基因組由8個單股負鏈RNA組成，共編碼12-13種蛋白，根據表面蛋白HA和NA，已知可分為16種HA亞型和9種NA亞型血清型。根據AIV對雞的致病性不同，可以將AIV分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）。目前，已有禽流感病毒H5N1、H5N2、H5N6、H9N2、H7N7、H10N7和H10N8等均有感染人的報道。2013年3年31日首先在中國上海和安徽發現了3例人感染H7N9禽流感病例，截止2017年3月8日，根據世界動物衛生組織（OIE）、聯合國糧農組織（FAO）和有關權威機構的報告，人感染H7N9亞型禽流感累計病例數達1292例。由於H7N9亞型禽流感對人的高死亡率，對公共衛生安全和社會穩定造成較大的影響，對於該病防控，進行監測和早期診斷顯得尤為重要。近幾年來，熒光免疫層析技術在膠體金層析技術的基礎上得到了較大的改進,已經廣泛應用於動物疫病監測和診斷，為了驗證熒光免疫層析法檢測H7亞型禽流感病毒可行性，對該方法的特異性、敏感性和穩定性進行了驗證，並對採集的臨床樣品進行了檢測，現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1臨床樣品

採自三鳥批發市場，共100份，其中雞洩殖腔拭子50份，雞喉拭子50份，用PBS液-20℃保存。

1.2試劑和儀器

H7N9亞型禽流感抗原、H7N2亞型禽流感抗原、H5N1亞型禽流感抗原、H9N2亞型禽流感抗原、新城疫抗原為哈爾濱維科生物技術開發公司，批號分別為：2014002、2014001、2015028、20150403、20150403；H5N2亞型禽流感抗原由華南生物有限公司提供，批號：20140520；H6N6亞型禽流感抗原由英國國家實驗室，批號：06606-070306；H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條由深圳市易瑞生物技術有限公司提供，批號：20160104；熒光檢測儀由深圳市易瑞生物技術有限公司提供。

1.3方法

1.3.1 特異性試驗方法

用2mL PBS分別溶解H7N9亞型禽流感抗原、H7N2亞型禽流感抗原、H5N1亞型禽流感抗原、H5N2亞型禽流感抗原、H6N6亞型禽流感抗原、H9N2亞型禽流感抗原、新城疫抗原，分別用PBS液1:10稀釋，用移液器吸75uL加入H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15min後，用熒光檢測儀讀取數值，結果判定以 cut off值大於等於80判為陽性，小於80判為陰性。

1.3.2 敏感性試驗

分別用PBS液10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍稀釋H7N9亞型禽流感抗原和H7N2亞型禽流感抗原，用移液器吸75uL加入H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15min後，用熒光檢測儀讀取數值，結果判定以 cut off值大於等於80判為陽性，小於80判為陰性。

1.3.3 變異係數

用PBS液1:1000稀釋H7N9亞型禽流感抗原，用移液器吸75uL加入H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15min後，用熒光檢測儀讀取數值，結果判定以 cut off值大於等於80判為陽性，小於80判為陰性。

1.3.4 臨床樣品檢測

用移液器吸75ul臨床樣品加入H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條上，15min後，用熒光檢測儀讀取數值，結果判定以 cut off值大於等於80判為陽性，小於80判為陰性。

2結果

2.1特異性試驗結果

採用H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測不同毒株抗原，結果為H7N9亞型禽流感抗原，H7N2亞型禽流感抗原陽性；H5N1亞型禽流感抗原、H5N2亞型禽流感抗原、H6N6亞型禽流感抗原、H9N2亞型禽流感抗原、新城疫抗原均為陰性，詳細結果表1。結果表明，H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能夠檢出H7N9、H7N2亞型流感病毒，而對其他毒株檢測結果均為陰性，H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條特異性強。

表1不同亞型禽流感抗原和新城疫抗原檢測結果

2.2敏感性結果

H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能檢測出到1：1000倍稀釋的H7N9亞型禽流感抗原陽性，1：10000倍稀釋以後的檢測結果為陰性；能檢測到1：1000倍稀釋的H7N2亞型禽流感抗原檢測結果為陽性，1：1000倍稀釋以後的檢測結果為陰性，詳細結果見表2。結果表明，H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條能夠檢出H7N9、H7N2亞型禽流感抗原（血凝效價1:512）1000倍的稀釋度。

表2不同稀釋度H7N9、H7N2亞型禽流感抗原檢測結果

2.3變異係數檢測結果

採用H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測10次1:1000稀釋的H7N9亞型禽流感抗原，結果均為陽性，詳細結果表3，變異係數為1.12%，差異不顯著，結果表明H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測結果穩定。

表3H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條穩定性檢測結果

2.4臨床樣品的檢測結果

採用H7亞型流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測臨床樣品共100份，其中雞洩殖腔拭子50份，雞喉拭子50份，結果均為陰性，詳細結果見表4。

表4 部分臨床樣品H7亞型流感病毒檢測結果

3討論

H7N9亞型禽流感是一種新型禽流感，傳染源主要是帶毒的家禽或家禽感染後通過糞便、唾液和鼻腔分泌物和糞便等排出的病毒，人主要是通過接觸染毒家禽或者被其汙染的物品或環境引起感染。根據研究表明，活禽暴露是人感染H7N9流感的關鍵風險因素，活禽交易市場是傳染源之所在，從對市場調查的結果來看，市場汙染嚴重。為了加強在源頭上的控制，做好活禽交易市場的檢疫，及時發現H7N9流感病毒, 建立H7N9流感病毒的快速檢測方法顯得尤為重要。傳統的H7N9流感病毒檢測方法，包括病毒分離鑑定，熒光RT-PCR方法、普通RT-PCR方法或者是HA和NA擴增後的測序。這些方法存在費時費力或對實驗室生物安全等級要求高的缺點。熒光免疫層析法使用熒光微球標記，捕獲被測樣本中的H7亞型流感病毒，此次試驗結果表明，應用該方法檢測H7亞型流感病毒特異性強，可以檢測到1000倍稀釋的H7N9亞型禽流感抗原，穩定性好，適合大規模樣品的檢測。目前，我國流行的H7亞型流感的主要為H7N9亞型流感，採用熒光免疫層析法檢出H7亞型流感陽性的樣品需再進一步進行熒光RT-PCR檢測或病毒分離鑑定，確定H7亞型流感的型別。

熒光免疫層析法是在膠體金免疫層析技術上的改進，改進後的熒光免疫層析法與膠體金免疫層析技術相比更具有優勢，其示蹤標記物採用更靈敏的熒光納米微球，根據試驗的結果顯示熒光免疫層析法比膠體金靈敏度要提高100-1000倍，並且熒光免疫層析法採用手持式熒光儀讀取數值，受人為因素影響小，整個試驗過程只需20min。熒光免疫層析法操作簡便、試驗時間短、不受人為因素影響適合活禽交易市場和養殖場H7亞禽流感病毒初篩，為防控H7N9流感提供了一個新技術。

（參考文獻略）

作者及來源

作者：張險朋，盧沛炯，鄭騰，萬慶文，黃炳熾

摘自《動物防疫一線》2017年第4期