乾貨分享，基因組DNA測序文庫構建

1.對收到的DNA樣品進行檢測，取2-3uL樣品，用1%的瓊脂糖膠檢測，對於純度不夠(含RNA或蛋白)的DNA樣品需要柱純化後重新檢測。

對於細菌基因組需要擴增16S全長序列，進行驗證。對於噬菌體或者質粒樣品，若用16S全長引物擴增，無目的條帶則無細菌基因組汙染，若出現目的條帶則存在汙染，需要去除後建庫。

2.用Qubit檢測DNA樣品濃度。

3.吸取部分DNA樣品，用TE或Elution Buffer稀釋，終濃度在10ng/ul-30ng/ul之間，體積為130ul。用Covaris破碎，破碎時請根據需要片段大小，按標準操作流程操作。

4.樣品足夠多的情況下，可以取適量破碎後的產物進行PAGE膠或者瓊脂糖膠檢測。

5.對破碎後的產物進行柱式法(5倍體積的B3+100-200ul異丙醇)濃縮回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脫。回收產物用Qubit測值。

6.修平和磷酸化

100ul體系

DNA 1ug

5 X T4 polymerase buffer 20ul

BSA (5mg/ml) 2ul

ATP (100mm) 1ul

dNTP（10mm） 10ul

T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul

Klenow（10U/ul） 1ul

T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul

22°C反應20min，柱式法純化,50-100ul TE洗脫。純化後Qubit測值。

7.加‘A’

100ul體系

DNA 0.5-2.5ug

10 X klenow buffer 10ul

dATP(10mm) 1-3ul

Klenow(exon-)（5U/ul） 1-3ul

37°反應20min，柱式法純化，50-100ul TE洗脫。純化後Qubit測值。

8.連接頭

200ul體系

10 X T4 DNA ligase buffer 20ul

PEG4000 30ul

ATP(100mm) 2ul

DNA X

接頭 Y

T4 DNA ligase 1.5-2ul

加水至 200ul

DNA與接頭的摩爾比約在1:3至1:10之間。

9.連接產物用柱式法純化後，跑瓊脂糖膠切割目的區域回收。

10.PCR擴增

10 X TagE buffer 5ul

Mg2+ 4ul

dNTP(10mm) 1ul

lib-PCR-F 0.5ul

lib-PCR-R 0.5ul

tagE 0.5ul

DNA 5ul

ddH2O 33.5ul

11.瓊脂糖膠回收。

12.Qubit測值，總量足夠的情況下，取3ul跑膠檢測。

13.附錄

T4 DNA Polymerase由於同時具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用於將5'端突出末端補平或3'端突出末端削平。T4 DNA Polymerase的3'→5'DNA外切酶活性對於單鏈DNA要比雙鏈DNA活性更高，即單鏈DNA要比雙鏈DNA中的非配對鏈部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。

T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高約200倍。

DNA 聚合酶I大片段 (Klenow片段) 是E. coli DNA聚合酶I的蛋白水解產物，具有DNA聚合酶活性和3' →5'核酸外切酶活性，但缺失了5' →3'核酸外切酶活性。Klenow既保留了全酶的高保真性，又不會降解DNA 5'末端。注意：由於該酶具有3' →5'核酸外切酶活性，升高反應溫度、加入過量的酶、未加入dNTP或反應時間過長均會導致DNA末端鹼基被切除形成凹陷。

T4 多聚核苷酸激酶能夠催化磷酸在ATP的 γ-位和寡核苷酸鏈 (雙鏈或單鏈DNA或RNA) 的5′-羥基末端以及3′-單磷酸核苷間進行轉移和交換，1個Richardson單位，指37℃條件下，30分鐘內1U催化1nmol酸不溶性[32P]摻入所需要的酶量 。

Klenow片段(3´→5´exo-)是大腸桿菌DNA聚合酶I的蛋白水解產物。它保留了DNA聚合酶活性，但失去了5´→3´外切核酸酶活性。該酶經突變(D355A, E357A) 去除了其3´→5´的外切核酸酶活性(1) 。1單位指在37°C條件下，30分鐘內能使10nmol的dNTPs 摻入酸不溶性沉澱物所需要的酶量。注意：Klenow片段(3´→5´exo-)因去除了3´→ 5´外切酶的活性，故不適宜用於生成平末端的反應。當用於雙脫氧法DNA序列測定時(3) ，建議用1unit/5μl反應體系。